Analise de expressão gênica

A plataforma Nanostring nCounter® é amplamente utilizada para pesquisa e aplicações clínicas devido à sua capacidade de medir uma ampla gama de níveis de expressão de mRNA¹. A téctinica é altamente sensível, precisa e reprodutível². Com o intuito de contribuir com a comunidade open source vou compartilhar esse trabalho que realizei e me orgulho muito dele, fiquem a vontade para sugestões!! 😊

A análise é divida em 3 estapas principais que estão esquematizados na imagem ao lado

🔹Normalização dos dados

A principal e a primeira etapa da análise é a normalização realizada para reduzir erros aleatórios e efeitos de batches. A precisão e confiabilidade dos resultados dependem da normalização adequada dos dados em relação aos genes de referência. O método de normalização por housekeeping é frequentemente escolhido quando se trata de expressão gênica, entretanto é importante salientar que até mesmo os housekeepings podem sofrer variação na expressão³.

🔹Analise de expressão diferencial

A analise diferencial é realizada após a normalização para comparar a expressão entre dois grupos. O pacote que utilizo nessa análise é o limma. Esse pacote foi desenvolvido primeiramente para análise de Micro Array mas ficou muito popular na análise de RNA-seq. O limma segue um fluxo de trabalho comum. Primeiro a comparação entre os grupos, que é o desing do experimento. Depois o modelo é ajustado e por fim aplicado o método empirico de Bayes

O out-put da análise inclui:

• logFC: O log do fold-change entre os grupos comparados.
• t: A estatística-t para avaliar a expressão diferencial.
• P.Value: O valor de P para expressão diferencial, esse valor não está ajustado para múltiplos testes.
• adj.P.Val: O valor de P ajustado para testes múltiplos. Existem diferentes métodos de ajuste o default é o Benjamini-Horchberg.

🔹Visualização dos dados

E por fim a visualização dos dados, o tipo gráfico mais utilizado nessa etapa é o heatmap, entretanto existem outras opções, como o volcano plot por exemplo. A clusterização é o principal componete da visualização do heatmap, o cluster hieraquico é utilizado nessa análise.

Algumas outras etapas são necessárias para melhorar a análise e obter um resultado mais confiável. Vou disponibilizar o script de todas essas estapas prévias a normalização.

referências:

Footnotes

1. A new normalization for Nanostring nCounter gene expression data ↩

2. Application of NanoString technologies in companion diagnostic development ↩

3. An approach for normalization and quality control for NanoString RNA expression data ↩